凝胶电泳技术在DNA片段分离中的应用及高考考点解析

一、凝胶电泳技术的基本原理与应用

1. 基本原理

凝胶电泳利用电场驱动带电分子（如DNA）在凝胶介质中迁移，根据分子大小、构象和电荷差异实现分离。DNA因糖-磷酸骨架带负电荷，在电场中向正极移动，迁移速度与分子量成反比，小分子迁移更快。琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶是常用介质，前者适用于较大DNA片段（0.2-50kb），后者分辨率更高，适合小片段（1-1000bp）。

2. 技术分类

琼脂糖凝胶电泳：用于常规DNA分离，通过调整琼脂糖浓度（如1%用于0.5-10kb片段）控制凝胶孔径，影响分辨率。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：分非变性和变性两种，后者添加尿素或甲酰胺，消除碱基序列对迁移率的干扰，常用于DNA测序。

脉冲场凝胶电泳（PFGE）：通过周期性变换电场方向分离超大DNA分子（如整条染色体），适用于分子流行病学研究和病原体追踪。

3. 显色与检测

常用溴化乙锭（EB）或SYBR Safe等荧光染料染色，紫外光下DNA-染料复合物发出荧光，条带亮度与DNA含量成正比。EB染色灵敏度高，可检测0.05μg的DNA。

4. 影响因素

分子大小：线状DNA迁移率与分子量对数成反比。

凝胶浓度：高浓度凝胶（如2%）适合小片段，低浓度（如0.3%）适合大片段。

电压：低电压（5V/cm以下）提高大片段分辨率，高电压可能导致条带模糊。

二、高考高频考点解析

1. 电泳图与遗传病分析

显隐性判断：若患者电泳仅显示一条带（纯合子），正常个体显示两条带（杂合子或显性纯合），可推断隐性遗传病。例如，隐性致病基因突变可能产生限制性酶切位点，电泳条带数目变化（如从1条变为2条）。

遗传方式判断：结合家系图和电泳结果，若男性患者母亲携带致病基因，可能为X隐性遗传；若父母正常但女儿患病，则为常染色体隐性遗传。

例题（2022湖南卷）：突变型1基因C1因碱基替换产生新酶切位点，电泳结果显示Ⅲ（含未切割的C基因条带和切割后的C1条带），可推断突变型为杂合子。

2. 基因型推断与概率计算

杂合子鉴定：若个体电泳显示两条带（如基因A和a），则为杂合子。

患病概率计算：结合电泳结果和遗传规律，计算子代患病概率。例如，若父母均为携带者（Aa），子代患病概率为25%。

例题（2020山东卷）：乙病电泳显示患者仅一条带（隐性纯合），正常个体两条带（显性杂合或纯合），结合家系图可判断乙病为常染色体隐性遗传。

3. 分子量判断与限制酶分析

限制酶图谱分析：通过电泳条带长度推断酶切位点。例如，目的基因插入质粒后，用不同限制酶切割，对比Marker判断插入方向。

基因突变检测：若突变引入新酶切位点，电泳条带数目或大小改变，可识别突变类型（如碱基替换或缺失）。

三、实验操作注意事项（高考实验题考点）

1. 缓冲液选择：必须使用TAE或TBE缓冲液，避免使用水导致凝胶融化。

2. 上样量控制：过多样品导致条带重叠，过少则无法检测，需根据DNA浓度调整。

3. 电压与时间：高电压缩短电泳时间但降低分辨率，推荐4-10V/cm。

4. 染色安全：EB为潜在致癌物，需戴手套操作；SYBR Safe更安全但灵敏度稍低。

凝胶电泳是分子生物学核心实验技术，高考中常结合遗传学、基因工程等知识点考查电泳图分析能力。掌握以下关键点：

1. 电泳原理与分类：琼脂糖与聚丙烯酰胺凝胶的适用场景。

2. 电泳图解读：条带数目与基因型对应关系，显隐性及遗传方式判断。

3. 实验设计：限制酶选择、突变检测及概率计算。

4. 操作细节：缓冲液、电压、染色剂的选择与安全操作。

通过典型例题训练（如湖南、山东卷真题），可强化电泳图分析思维，提升遗传题解题效率。