1. 获取乙肝表面抗原（HBsAg）基因

  • 来源：从乙肝病毒（HBV）基因组中分离编码HBsAg的S基因片段。也可通过反转录法或化学合成法获得该基因序列。
  • 优化设计：为提高表达效率，需根据宿主（如酵母或哺乳动物细胞）的密码子偏好性对基因序列进行密码子优化（如网页90中多形汉逊酵母的密码子优化案例）。

    • 2. 构建重组表达载体

  • 载体选择：常用质粒或病毒载体，需包含启动子（如酵母的MOX启动子）、终止子、筛选标记（如抗生素抗性基因）和复制原点。
  • 酶切与连接：用限制性内切酶（如BamHI、EcoRI）切割目的基因和载体，通过DNA连接酶将两者连接形成重组质粒。

    • 3. 导入宿主细胞

  • 常用宿主：酵母（如汉逊酵母、酿酒酵母）或哺乳动物细胞（如CHO细胞），因其具备翻译后修饰功能，能正确折叠HBsAg蛋白。
  • 转化方法：电转化法或化学转化法，如将重组质粒导入酵母细胞后筛选阳性克隆。

    • 4. 发酵培养与蛋白表达

  • 高密度发酵：在可控发酵罐中进行，通过诱导表达（如甲醇诱导）使宿主大量合成HBsAg蛋白。多形汉逊酵母的发酵液HBsAg产率可达85mg/L以上。
  • 分泌特性：部分酵母菌能将HBsAg分泌至胞外，简化后续纯化步骤。

    • 5. 蛋白纯化与疫苗制备

  • 纯化技术：采用超滤、硅胶吸附、疏水层析（如丁基琼脂糖层析）和离子交换层析等步骤，去除宿主蛋白和杂质。
  • 灭活与制剂：将纯化的HBsAg经甲醛灭活后，与佐剂（如氢氧化铝）混合制成疫苗注射液或冻干粉针。

    • 6. 质量检测与验证

  • 抗原活性：通过血凝试验或ELISA检测HBsAg的免疫反应性。
  • 安全性：检测热原质、残留DNA及无菌性，确保疫苗符合药典标准。

    • 二、高考选修模块（基因工程）重点解析

    1. 核心工具与原理

  • 工具酶：限制性内切酶（识别特定序列并切割）、DNA连接酶（连接黏性末端或平末端）、Taq酶（PCR扩增）。
  • 载体功能：需具备复制原点、启动子、终止子、多克隆位点和标记基因（如氨苄青霉素抗性基因）。

    • 2. 关键操作流程

  • PCR技术：需掌握引物设计原则（如引物间避免互补）、退火温度计算及循环步骤（变性、退火、延伸）。
  • 重组质粒构建：注意酶切位点选择（避免载体自连）、连接方向及转化后筛选（如蓝白斑筛选）。

    • 3. 基因表达与检测

  • 启动子与终止子：启动子（如乳糖操纵子）需能被宿主RNA聚合酶识别；终止子防止基因过度转录。
  • 检测方法：
  • DNA水平：PCR、Southern blot。
  • 蛋白水平：抗原-抗体杂交（如检测重组人胰岛素）。

    • 4. 应用实例与实验设计

  • 疫苗生产：乙肝疫苗是典型案例，需理解基因重组技术与传统灭活疫苗的区别。
  • 植物抗虫基因工程：Bt毒蛋白基因的克隆与转化流程（如网页51中抗虫棉案例）。

    • 5. 高考高频考点

  • 载体构建问题：如双酶切后连接的优势（避免载体自连）。
  • 标记基因的作用：区分重组体与非重组体（如抗生素筛选）。
  • 基因文库类型：基因组文库与cDNA文库的区别（内含子存在与否）。

    • 三、总结

    DNA重组技术制备乙肝疫苗的核心在于目的基因的优化表达与高效纯化，涉及基因工程全流程。高考选修模块需重点掌握工具酶、载体构建、检测技术及应用案例，尤其关注实验设计题（如PCR引物设计、重组质粒验证）和原理分析题（如启动子功能）。