一、PCR技术的基本原理与步骤

1. 原理

PCR（聚合酶链式反应）基于DNA半保留复制原理，通过体外模拟DNA复制过程，对特定DNA片段进行指数级扩增。其核心是通过温度调控实现变性、复性（退火）、延伸的循环。

2. 步骤

  • 变性：加热至90~95℃，使双链DNA解链为单链模板。
  • 退火：降温至50~65℃，引物与模板单链的互补序列结合。
  • 延伸：升温至72℃，耐高温的Taq DNA聚合酶以dNTP为原料，从引物的3'端延伸合成新链。

    • 3. 反应体系

    包括模板DNA、引物（两种）、耐高温DNA聚合酶、dNTP、缓冲液（含Mg²⁺）等。其中，引物设计是关键，需满足以下条件：

  • 与模板两端序列互补；
  • 避免引物自身或引物间形成二级结构；
  • GC含量40%~60%，长度通常15~30 bp。

    • 二、PCR在基因诊断中的应用

    1. 基因诊断的核心技术

    PCR可用于快速扩增病原体（如病毒、细菌）的特异性基因片段，结合荧光探针或凝胶电泳检测目标序列是否存在。例如，新冠病毒核酸检测采用实时荧光定量PCR，通过荧光信号判断病毒RNA的存在。

    2. 特异性与灵敏度

  • 特异性：由引物决定，引物与目标序列的精准配对确保扩增产物的唯一性。
  • 灵敏度：可检测极微量的DNA（如单个拷贝），适用于早期感染诊断。

    • 3. 常见应用场景

  • 遗传病检测：如地中海贫血、囊性纤维化等单基因病的基因突变筛查。
  • 传染病诊断：如HIV、HPV的核酸检测。
  • 法医学：通过扩增STR序列进行个体识别。

    • 三、高考高频考点

    1. PCR与体内DNA复制的区别

    | 对比项 | PCR | 体内DNA复制 |

    ||-|--|

    | 解链方式 | 高温变性（无需解旋酶） | 解旋酶催化解链 |

    | 引物类型 | DNA引物 | RNA引物 |

    | 酶 | Taq DNA聚合酶（耐高温） | DNA聚合酶、解旋酶等 |

    | 温度条件 | 循环变温（高温变性，低温退火） | 恒定体温环境 |

    | 产物连续性 | 两条链均连续合成 | 一条链连续，另一条链不连续（冈崎片段） |

    2. 循环次数与产物计算

  • 公式：产物数量 = 2ⁿ（n为循环次数）。
  • 第3次循环后开始出现两端等长的目的基因片段。
  • 引物消耗量：需消耗（2ⁿ+1
  • 2）个引物。

    • 3. 实验操作易错点

  • 假阳性：可能因试剂污染或引物设计不当导致非特异性扩增。
  • 假阴性：模板量不足、引物失效或反应条件错误（如退火温度过高）。

    • 4. 荧光定量PCR技术

  • 利用荧光探针（如TaqMan探针）实时监测扩增产物，通过Ct值（达到荧光阈值的循环数）定量目标DNA浓度。

    • 四、真题演练示例

    例题：设计一对引物扩增某基因片段，已知模板链序列为5'-ATGC...（中间序列）...CGTA-3'。

    要求：写出两种引物的序列，并说明设计依据。

    答案：

  • 引物1：5'-ATG...-3'（与模板链5'端互补）；
  • 引物2：5'-TACG...-3'（与互补链的5'端互补）。

    • 依据：DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸，因此引物需与模板链的3'端互补。

    五、总结

    PCR技术的核心考点包括原理、步骤、引物设计、与体内复制的区别、应用场景及实验分析。基因诊断的考察常结合临床案例（如病毒检测）或实验设计（如引物选择），需重点掌握循环次数计算、产物类型分析及错误原因推断。