一、基因检测技术核心原理与工具

1. PCR技术

  • 原理：通过高温变性（90-95℃）、低温退火（引物结合）、中温延伸（DNA聚合酶合成新链）扩增目的基因片段。
  • 高考重点：引物设计（5'端添加限制酶位点，避免影响延伸）、结果分析（电泳条带长度与数量）。
  • 应用：快速检测病原体（如新冠病毒）、遗传病基因筛查（如苯丙酮尿症）。

    • 2. 下一代测序（NGS）

  • 特点：高通量、高灵敏度，可同时检测多个基因突变。
  • 应用：肿瘤基因突变分析（如EGFR、HER2）、全基因组关联研究。

    • 3. 基因芯片技术

  • 原理：利用探针与样本DNA/RNA杂交，检测基因表达或突变。
  • 应用：遗传多态性分析、癌症分型诊断。

    • 二、基因工程工具与操作流程

    1. 工具酶与载体

  • 限制酶：识别特定序列（如EcoRⅠ识别GAATTC），产生黏性末端或平末端。
  • DNA连接酶：连接黏性末端（常用T4连接酶）或平末端（效率低）。
  • 质粒载体：需具备复制原点、启动子、标记基因（如抗生素抗性基因）。

    • 2. 操作流程

  • 四步核心步骤：

    • 1. 获取目的基因：PCR扩增、化学合成或从cDNA文库中获取（避免内含子问题）。

    2. 构建表达载体：需插入启动子（如乳腺特异启动子用于生物反应器）、终止子。

    3. 导入受体细胞：

  • 植物：农杆菌转化法（双子叶植物）。
  • 动物：显微注射法（受精卵）。

    • 4. 检测与鉴定：

  • 分子水平：PCR/核酸杂交检测DNA，抗原-抗体杂交检测蛋白质。
  • 个体水平：观察性状（如抗虫植物）。

    • 三、医学诊断中的应用实例

    1. 遗传病筛查

  • 新生儿筛查：检测苯丙酮尿症、先天性甲状腺功能减退症。
  • 技术选择：PCR结合电泳、基因芯片。

    • 2. 肿瘤诊断与治疗

  • 基因检测：HER2扩增（乳腺癌）、EGFR突变（肺癌）指导靶向治疗。
  • 液体活检：通过循环肿瘤DNA（ctDNA）进行无创诊断。

    • 3. 个体化用药

  • 药物基因组学：检测CYP2C9基因型指导华法林剂量，避免不良反应。

    • 四、高考高频考点与解题技巧

    1. 实验设计题

  • 载体构建：双酶切防止自连（如用BamHⅠ和HindⅢ切割质粒和目的基因）。
  • 标记基因筛选：双抗生素抗性（如Ampr和Tetr）排除未重组质粒。

    • 2. 长难句分析

  • 引物作用：“使DNA聚合酶从3'端延伸”需结合模板链互补性。
  • cDNA文库优点：无内含子，适合原核表达系统。

    • 3. 与风险

  • 基因隐私：检测结果可能被滥用，需法律保护。
  • 技术局限性：假阳性/假阴性风险（如PCR污染）。

    • 五、易错点提醒

    1. 限制酶选择：需注意黏性末端匹配，避免反向连接。

    2. 检测方法混淆：DNA杂交（检测基因存在）≠抗原-抗体杂交（检测蛋白表达）。

    3. 标记基因≠目的基因：标记基因仅用于筛选，与目的基因功能无关。

    参考资料整合：网页1、30、40、47、59、63等。建议结合真题演练，重点掌握PCR原理、载体构建逻辑及医学应用实例！